流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)方法

1. 流式細(xì)胞儀的概述

流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和分析系統(tǒng)四部分組成。測量原理是鞘液和樣品流在噴嘴附近組成個圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光或產(chǎn)生散射光，這些信號分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。主要應(yīng)用于分析細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)、細(xì)胞受體、腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA含量等方面。

2. 術(shù)語

等量可溶性熒光分子（MESF）：顆粒發(fā)出的熒光信號強(qiáng)度相當(dāng)?shù)目扇苄詿晒馑胤肿拥奈镔|(zhì)的量濃度。用于表示顆粒發(fā)出的熒光信號強(qiáng)度。

3.流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)

（1）環(huán)境條件

室溫為（15~30）℃，室內(nèi)相對濕度：≤70%。

（2）校準(zhǔn)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

a.  單一熒光強(qiáng)度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

b.  多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

c.  計(jì)數(shù)熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

d.  淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

注：校準(zhǔn)時應(yīng)采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，相對擴(kuò)展不確定度不超過20% (k=2)。

（3）校準(zhǔn)項(xiàng)目

a.  外觀檢查

b.  分辨力

c.  線性相關(guān)系數(shù)

d.  檢出限

e.  漂移

f.  重復(fù)性

g.  示值誤差

（4）外觀檢查

用目測、手動法進(jìn)行檢查。

（5）分辨力校準(zhǔn)

a.  儀器經(jīng)預(yù)熱，進(jìn)入正常工作狀態(tài)；

b.  在裝有0.5 mL經(jīng)過0. 22 μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，移取0.5 mL單一熒光強(qiáng)度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，充分混勻后上機(jī)實(shí)驗(yàn)；

c.  記錄前向角散射光和488 nm激發(fā)下兩個熒光通道，包括綠色熒光（FITC 異硫氰酸熒光素）、橙紅色熒光（PE藻紅蛋白）；

d.  收集門內(nèi)有效信號10000個，計(jì)算前向角散射光和兩個熒光通道中校準(zhǔn)微球峰寬的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為分辨力。

（6）線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)

a.  在裝有1mL經(jīng)過0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中加入20μL多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，充分混勻后上機(jī)實(shí)驗(yàn)；

b.  記錄488 nm激發(fā)下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道信號；

c.  對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直方圖分析，熒光強(qiáng)度從低到高至少5種不同的熒光強(qiáng)度峰，每個峰收集10000個門內(nèi)有效信號，得到每個峰的平均熒光強(qiáng)度；

d.  根據(jù)校準(zhǔn)微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的各個峰的等量可溶性熒光分子（MESF），將各峰的MESF取對數(shù)lg（MESF），簡化表示為y，各峰測量的平均熒光強(qiáng)度取對數(shù)lg（FITC）或lg（PE），簡化表示為x，將兩者線性回歸得到方程y=kx+b，計(jì)算兩個通道的線性相關(guān)系數(shù)（r）。

（7）檢出限校準(zhǔn)

a.  針對綠色熒光（FITC）和橙紅色熒光（PE）熒光通道，采用線性相關(guān)系數(shù)中得到的線性回歸方程y=kx+b；

b.  計(jì)算無熒光標(biāo)記的空白微球的平均熒光強(qiáng)度值對應(yīng)的MESF即為熒光檢出限。

（8）漂移校準(zhǔn)

a.  將周圍環(huán)境溫度控制在允許范圍（設(shè)定溫度±3℃）內(nèi)，在裝有1 mL經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入數(shù)滴單色熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，充分混勻后上機(jī)試驗(yàn)；

b.  記錄前向角散射光和488 nm激發(fā)下綠色熒光（FITC）、 橙紅色熒光（PE）通道的信號，收集10000個以上門內(nèi)有效信號；

c.  測試完成后，利用直方圖分析試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度值；

d.  連續(xù)開機(jī)2 h后，在相同流式細(xì)胞儀設(shè)置和熒光通道電壓值的條件下重復(fù)前述試驗(yàn)步驟，得到標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度值；

e.  計(jì)算相對漂移率來表示穩(wěn)定性。

（9）重復(fù)性校準(zhǔn)

a.  首先制備取100 μL淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按比例添加抗原決定簇CD4抗體，輕柔渦旋充分混勻，避光存放半小時，使CD4抗體與細(xì)胞充分結(jié)合；

b.  將淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)記好CD4抗體后上機(jī)測試，收集10000個以上門內(nèi)有效信號；

c.  重復(fù)測量6次，依次記錄每次測量的CD4陽性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比，計(jì)算CD4陽性細(xì)胞數(shù)量占總淋巴細(xì)胞的百分比的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為重復(fù)性的評價。

（10）      示值誤差校準(zhǔn)

按照測量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中得到的CD4陽性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比，計(jì)算平均值，然后計(jì)算示值誤差，最后評估示值誤差校準(zhǔn)不確定度。

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